RPP No. 1.5: Biotic transformations

Časový harmonogram řešení

Plán 2005 - 2006

Splněno 2005

Zúčastnění, plnění:

• M. Monincová, Z. Prokop:
  Byly naklonovány a charakterizovány dvě nové halogenalkandehalogenasy z Mykobakterií. Tyto enzymy vykazují nové biochemické vlastnosti, např. zvýšenou termostabilitu, nebo dvojí pH optimum. Enzymy bude možné využít pro konstrukci biosensorů plánovanou v dalších letech projektu.
• R. Chaloupková, Z. Prokop, J. Damborský:
  Byl zkonstruován nový systém pro expresi halogenalkandehalogenas v kvasinkách Pichia pastoris. Systém umožňuje extracelulární expresi proteinu, což je výhodné pro kontinuální produkci biokatalyzátoru. Byla pozorována posttranslační modifikace proteinu, která však nemá vliv na jeho aktivitu nebo termostabilitu.
• Z. Prokop:
  Byla vyvinuta nová metoda pro automatické monitorování mikrobiální degradace nitrofenolických látek, které jsou rozšířenými kontaminanty životního prostředí. Metoda využívá mikrodestičkovou čtečku BioscreenC k automatickému odečtu absorbčních degradačních profilů. Tato metoda probíhá v nízkých objemech (< 300 µL) a umožňuje tak rychlé zpracování velkého množství vzorků při screeningu degradační aktivity bakterií proti nitrofenolickým látkám a jiným kontaminantům životního prostředí, které vykazují spektrofotometrickou odezvu.
• Z. Prokop, J. Damborský:
  Byla otestována akutní toxicita a genotoxicita sedmnácti halogenovaných alifatických sloučenin s využitím mušky octomilky Drosophila melanogaster. Naměřená data byla doplněna molekulární deskriptory a vytvořen QSAR model, který lze využít k předpovídání nebezpečnosti halogenovaných látek pro živé organismy.
• J. Damborský:
  Počítačovým modelováním a proteinovou krystalografií byl studován mechanismus zrychlené dehalogenace 1,2,3-trichlorpropanu mutantními proteiny DhaA. Každá ze dvou mutací vykazovala rozdílný efekt na rychlost katalýzy jednotlivých reakčních kroků tohoto enzymu.

Plán 2006

• Budeme pokračovat v klonování, izolaci a charakterizaci nových enzymů. Konkrétně naklonujeme halogenalkandehalogenasy z bakterií Rhodopirulella baltika (gen drbA) a Mycobacterium tuberculosis (dmbC).
• Provedeme optimalizaci degradace yperitu halogenalkanehalogenasou LinB.
• Zahájíme přípravu prvních fluorescenčních optických biosensorů a měření na prototypu přístroje vyrobeného na Univerzitě Hannover v Německu (v 1-letém předstihu oproti původnímu plánu). Optické biosenzory budou založeny na citlivé detekci pH změn souvisejících s reakcí halogealkandehalogenas zakotvených na biosenzoru a citlivých na přítomnost halogenovaných sloučenin v monitorovaném prostředí.
• Zahájíme rovněž vývoj jednoduchého a levného typu elektrochemického biosenzoru. Senzor bude založený na detekci chloridů na uhlíkové pastové elektrodě nebo na elektrodě ze skelného uhlíku, jak ve stacionárním, tak průtokovém systému. Pro dosažení lepší senzitivity a selektivity bude vyzkoušena uhlíková pastová elektroda modifikovaná přídavkem dusičnanu stříbrného. Předpokládáme, že modifikace elektrody zlepší limit detekce chloridů o jeden až dva řády. Elektrochemické biosenzory budou testovány s imobilizovanými dehalogenasami, schopnými odštěpovat z halogenovaných uhlovodíků halogen, který bude senzorem detegován.

Relevantní publikace

Časopisy:

• Jesenská, A., Pavlová, M., Strouhal, M., Chaloupková, R., Těšínská, I., Monincová, M., Prokop, Z., Bartoš, M., Pavlík, I., Rychlík, I., Möbius, P., Nagata, Y., Damborský, J., 2005: Mycobacterial Haloalkane Dehalogenases: Cloning, Biochemical Properties and Screening. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6736-6745.
• Nakamura, T., Zámocký, M., Zdráhal, Z., Chaloupková, R., Monincová, M., Prokop, Z., Nagata, Y., Damborský, J., Expression of Glycosylated Haloalkane Dehalogenase LinB in Pichia pastoris. Protein Expression of Purification (in press).
• Tvrzová, L., Prokop, Z., Navrátilová, J., Mullerová, R., Neča, J. 2005: Development of a Microtiter Plate-Based Method for Determination of Degradation Profile of Nitrophenolic Compounds. Journal of Microbiological Methods (in press).
• Chroust, K., Pavlová, M., Prokop, Z., Mendel, J., Božková, K., Kubát, Z., Zajíčková, V., Damborský, J., 2005: Quantitative Structure-Activity Relationships for Toxicity and Genotoxicity of Halogenated Aliphatic Compounds: Wing Spot Test of Drosophila melanogaster. Chemosphere (submitted).
• Banáš, P., Otyepka, M., Vévodová, J., Jeřábek, P., Boháč, M., Petřek, M., Damborský, J., 2005: Molecular Mechanisms of Enhanced Conversion of 1,2,3-Trichloropropane by Mutant Haloalkane Dehalogenases Revealed by Structural and Computational Analysis. Biochemistry (submitted).

Přehled patentových přihlášek:

• Prokop, Z., Damborský, J., Opluštil, F., Jesenská, A., Nagata, Y., 2005: Method of Detoxification of Yperite by using Haloalkane Dehalogenases. Masaryk University, Brno, Czech Republic, CZ 2005 - 352 A1

Přednášky:

• Chrobaková, T., Jesenská, A., Chaloupková, R., Monincová, M., Sato, Y., Damborský J.: Cloning and Expression of Four New Putative Haloalkane Dehalogenases, Tomasek's days, June 8-10, 2005; Brno, Czech Republic (presented by TCH).
• Damborsky, J. , Jerabek, P. , Prokop, Z., Mozga, T., Sato, Y., Nagata, Y., Senda, T.: Computer-Assisted Engineering of Enantioselective Dehalogenases, 5th VUFB Conference: Modern Methods in the Synthesis and Analysis of Active Pharmaceutical Substances, November 23-24, 2005; Prague, Czech Republic.
• Jeřábek, P., Prokop, Z., Opluštil, F., Damborský, J.: Computational Modeling of the Degradation of Sulphur Mustard by Haloalkane Dehalogenases, IX. Working Meeting of Biochemists and Molecular Biologists, February 9-10, 2005; Brno, Czech Republic (presented by PJ).
• Mozga, T., Prokop, Z., Damborsky, J.: Enantioselectivity of Haloalkane Dehalogenases, IV. EMBO Young Investigator Programme PhD course, September 4-11, 2005; Heidelberg, Germany (presented by TM).
• Prokop, Z., Jerabek, P., Oplustil, F., Damborsky, J. 2005: Enzymatic Detoxification of Sulfur Mustard by Haloalkane Dehalogenases, 20th NATO Meeting "Non-Corrosive Biotechnology-Based Decontamination for Chemical and Biologycal Warfare Agents", June 7-8, 2005; Sonthofen Germany (presented by ZP).
• Prokop, Z., Mozga, T., Jerabek, P., Sato, Y., Nagata, Y., Senda, Y., Janssen, D.B., Damborsky, J.: The Use of Enzyme Catalysis In Bioorganic Synthesis, Progress In Organic, Bioorganic and Pharmaceutical Chemistry, November 18-20, 2005; Nymburk, Czech Republic (presented by ZP).

Postery:

• Mozga, T., Prokop, Z., Damborsky, J.: Enantioselectivity of Haloalkane Dehalogenases, IV. EMBO Young Investigator Programme PhD course, September 4-11, 2005; Heidelberg, Germany (presented by TM).
• Otyepková, E., Otyepka, M., Prokop, Z., Boháč, M., Jeřábek, P., Nevěčná, T., Damborský, J.: Srovnání průběhu nekatalyzované SN2 reakce acetátového iontu s 1,2-dichlorethanem a 1,2-dibromethanem s reakcí katalyzovanou enzymem halogenalkandehalogenázou, 57. zjazd chemických spoločností, September 4 -8, 2005; Vysoké Tatry, Slovak Republic (presented by EO).
• Sato, Y., Natsume, R., Prokop, Z., Senda, M., Damborsky, J., Nagata, Y., Tsuda, M., Senda, T.: Crystal Structure of the Haloalkane Dehalogenase DbjA, International Union of Crystallography XVIII congress and general assembly, August 23-31 2005; Florence, Italy (presented by YS).

Plán akci a publikaci na rok 2006:

• Organizace semináře Bioinformatics III.
• Instalace prototypu zařízení pro biosensing.
• Publikace v impaktovaných časopisech.